س خواهد بود بدين معني که ابتدا خاک توسط حلالي مناسب شسته شده و آلودگي‌هاي موجود در خاک در حلال مورد نظر حل شده و سپس در رآکتور‌هاي موسوم به TPPB عمل تماس بين فاز آلي شامل هيدروکربن‌هاي آروماتيک چند حلقه‌اي و فاز آبي شامل محيط کشت و باکتري انجام مي‌شود (بکايي 1388، 69).

2-10- ميکروارگانيسم هاي تجزيه کننده ترکيبات آروماتيک
ميکروارگانيسم هاي متعددي در اين عمل نقش دارند که برخي از مهمترين آنها عبارتند از:
Pseudomonas (Powlowski et al 1994, Sullivan and Lucas 1998, Gonzalez et al 2001, Kumar et al 2005, Kulkarni et al 2006, Yang and Lee 2007, Kotresha and Vidyasagar 2008, Saravanan et al. 2008) Rhodococcus (Margesin et al 2005) Micrococcus (Samanta et al 2002) Bacillus (Arutchelvan et al 2006) Mycobacterium (Pagnout et al 2007) Ochrobactrum (Kilic et a. 2007, Qiu et al. 2007, Zhang et al. 2007, Yamada et al. 2008) Rhodococcus (Samanta, et al 2002) Bacillus (Arutchelvan et al 2006) Penicillium (Leitao et al 2007) Candida (Hu et al 2006, Yan et al 2006) Staphylococcus (Mallick et al 2007, Lalevic et al 2012) Actinomyces (Diez 2010, Hamedi, Mohammadipanah et al. 2013) Acinetobacter (Fenja, Fischer et al. 2010) Alcaligenes (Deveryshetty and Prashant 2010) Mycobacterium (Badejo et al 2013, 58-60).

اصولا هيچ ميکروارگانيسمي به تنهايي قادر به تجزيه کامل هيدروکربن‌هاي نفتي به دي‌اکسيد‌کربن و آب بعنوان محصول نهايي نيست. امروزه با کمک مهندسي ژنتيک چندين پلاسميد را درون باکتري‌ها به خصوص سودوموناس قرار داده‌اند تا بتوانند چندين مشتق نفتي را بطور همزمان تجزيه کنند (Filonov et al 2003, 303-308).

2-11- مسير هاي تجزيه زيستي
2-11-1 تجزيه ميکروبي فنل

Phenol Phenol
Pseudomonas sp. Strain K172 Clostridium
hydroxybenzoicum JW/Z-
Phenylphosphate
Synthase
Phenylphosphate 4-hydroxybenzoate
Decarboxylase
Phenylphosphate
Carboxylase

v
4-hydroxybenzoate
4-hydroxybenzoate-CoA ligase
v
4-hydroxybenzoyl-CoA
4-hydroxybenzoyl-CoA reductase

Benzoyl CoA

To the
Anaerobic Benzoate
Pathway

Terephthalate
Decarboxylase
Benzoate Terephthalate
Thauera aromatic K172
Rhodopseudomonas palustris
From the Azoarcus evansii from the
Anaerobic Phenol Phthalate Family
Pathway Pathway
Benzoate-CoA
Ligase
From the from the
Anaerobic Toluene Benzoyl-CoA Anaerobic Ethylbenzene
Pathway and 2-Aminobenzoic acid
Benzoyl-CoA Pathways
Reductase
Cyclohex-2, 5-diene- Cyclohex-1, 5-diene- Cyclohex-1, 4-diene-
1-carboxyl-CoA 1-carboxyl-CoA 1-carboxyl-CoA

Cyclohex-1, 5-diene-
1-carboxyl-CoA
Hydratase
6-Hydroxycyclohex-1-ene- cyclohex-1-ene-
1-carboxyl-CoA 1-carboxyl-CoA

6-Hydroxycyclohex cyclohex-1-ene-
1-ene-1-carboxyl-CoA 1-carboxyl-CoA

Hydratase hydratase
2,6-Dihydroxycyclohexane- 2-hydroxycyclohexane-
1-carboxyl-CoA 1-carboxyl-CoA
2,6-Dihydroxycyclo- 2-hydroxycyclohexane-
Hexane-1-carboxyl-CoA 1-carboxyl-CoA
Dehydrogenase Dehydrogenase
6-Oxo-2-hydroxycyclohexane- 2-Ketocyclohexane-
1-carboxyl-CoA 1-carboxyl-CoA
6-oxo-2-hydroxycyclo- 2-ketocyclohexane-
Hexane-1-carboxyl-CoA 1-carboxyl-CoA
Hydrolase Hydrolase
Pimelyl-CoA
Pimelyl-CoA
Dehydrogenase
2,3-Didehydro-pimeloyl-CoA
Enoyl-CoA
Hydratase
3-Hydroxypimelyl-CoA
3-Hydroxypimelyl-CoA
Dehydrogenase
3-Ketopimelyl-CoA
3-Ketopimelyl-CoA
Thiolase
Glutarul-CoA
glutarul-CoA
dehydrogenase
Glutaconyl-CoA
glutaconyl-CoA
decarboxylase
Crotonoyl-CoA
enoyl-CoA
hydratase
from the
3-Hydroxyacyl-CoA Cyclopropanecarboxylate
Pathway
acetoacetyl-CoA
reductase
Acetoacetyl-CoA
acetoacetyl-CoA
thiolase
Acetyl-CoA

Intermediary
Metabolism (KEGG)
نمودار 2-1: مسير تجزيه ميکروبي فنل

2-11-2 تجزيه ميکروبي نفتالين

Naphthalene Naphthalene 1,2-Dihydronaphthalene
Bacillus thermoleovorans Pseudomonas sp. NCIB 9816-4, G7 Pseudomonas putida F39/D
Hamburg 2 Pseudomonas sp. Strain NCIB 9816/11
Naphthalene tolulene naphthalene
naphthalene 1,2-dioxygenase 1,2-dioxygenase 1,2-dioxygenase
2,3-dioxygenase
Cis-1,2-Dihydroxy-
2,3-Dihydroxy- 1,2-dihydro-
naphthalene naphthalene
1,2-dihydroxy-1,2-
Dihydronaphthalene
dehydrogenase
to the
Anthracene
Pathway 1,2-Dihydroxy- From the Phenanthrene Pathway
Naphthalene and Carbaryl Pathway
1,2-dihydroxy-
naphthalene
dioxygenase
2-Hydroxychromene-
2-carboxylate
(HCCA)
2-hydroxychromene-
2-carboxylate
isomerase
trans-o-Hydroxy-
benzylidenepyruvate
(tHBPA)
tHBPA
hydratase-aldolase
Salicylaldehyde
Salicylaldehyde
dehydrogenase
from the
Salicylate Dibenzofuran Pathway
Fluorene Pathway
salicylate
salicylate 1-Naphthoic Acid Pathway
5-hydroxylase hydroxylase Anthracene Pathway
Gentisate Catechol

Intermediary to the
Metabolism Nitrobenzene
(KEGG) Pathway

Nitrobenzene Nitrobenzene
Pseudomonas pseudoalcaligenes Comomonas sp.
JS45 Aniline JS765
Nitrobenzene Delftia sp. An3 Nitrobenzene
Nitroreductase and others 1,2-dioxygenase

from the
Nitrobenzene Catechol NAPH, BENZ2, HCH, ABZ2, PPC, PBA, ANT2, VAN
Aniline pathways
dioxygenase
Nitrobenzene
Nitroreductase
catechol catechol
Hydroxylaminobenzene 2,3-dioxygenase 1,2-dioxygenase
hydroxyl-
aminobenzene
mutase 2-Hydroxymuconic cis, cis-Muconate
semialdehyde
2-hydroxymuconate
2-Aminophenol semialdehyde
hydrolase
2-aminophenol
1,6-dioxygenase Cis-2-Hydroxy- Intermediary
penta-2,4-dienoate Metabolism
(KEGG)
2-Aminomuconic semialdehyde 2-oxopent-
4-enoate
hydratase
4-Hydroxy-
2-oxovalerate
Intermediary 4-hydroxy-
Metabolism 2-oxo-
(KEGG) valerate
aldolase

Pyruvate Acetaldehyde

Intermediary Intermediary
Metabolism Metabolism
(KEGG) (KEGG)
نمودار 2-2: مسير تجزيه ميکروبي نفتالين

فصل سوم:
روش شناسي تحقيق

3-1- محيط کشت‌هاي مورد استفاده
3-1-1 محيط ONR7a
محيط کشت پايه معدني است حاوي انواع نمک‌ها و املاح موجود در آب دريا که با توجه به منبع کربن افزوده شده به آن جهت جداسازي باکتري‌هاي تجزيه ‌کننده ترکيبات آروماتيک از آب دريا به کار برده مي‌شود. اين محيط از سه محلول مجزا ساخته مي‌شود که شامل محلول A, B و C مي‌باشد که ترکيب هر محلول در (جدول3-1) ذکر شده است.
جدول 3-1: ترکيبات محيط کشت ONR7a

فرمول
وزن محلول
محلول A
NaCl
??????gr

Na2SO4
???? gr

KCl
???? gr

NaBr
?? mgr

NaHCO3
?? mgr

H3BO3
?? mgr

NaF
??? mgr

NH4Cl
???? gr

NaHPO4.7H2O
?? mgr

TAPSO
??? gr
محلول B
MgCl2.6H2O
??.?? gr

CaCl2.2H2O
?.?? gr

SrCl2.6H2O
?? mgr
محلول C
FeCl2.4H2O
? mgr

پس از همگن کردن ترکيبات محيط کشت، در دماي C? ??? در فشار 25 پوند به مدت 15 دقيقه, هر کدام از محلول‌ها به طور جداگانه اتوکلاو شده است. منبع کربن اين محيط فنل و نفتالين با غلظت ثابت مي‌باشد. محلول‌ها به‌طور مجزا در دماي يخچال و در ارلن‌هايي که با پارافيلم درب آن‌ها گرفته شده, نگهداري شده اند.
3-1-2 محيط (ONR7a + نفتالين) آگار
ترکيبات تشکيل دهنده اين محيط مانند محيط ONR7aمي‌باشد اما به ازاي هر 1000 سي‌سي محيط 15 گرم آگار بدان افزوده شده است. پس از شفاف کردن هر کدام از محلول هاي A, BوC از طريق جوشاندن، آن‌ها در دماي C? 121 به مدت 15 دقيقه اتوکلاو شده‌اند. پس از اينکه دماي محيط به حدود C? 45 رسيد نفتالين حل شده در الکل 70% که فيلتر شده به آن اضافه شده است, سپس محلول هاي A, Bو C را به نسبت 2,2و1 با هم آميخته و در نهايت پس از تقسيم در پليت داخل يخچال و در تاريکي نگهداري شده‌اند.
3-1-3 محيط) +ONR7a فنل( آگار
ترکيبات تشکيل دهنده اين محيط مانند محيط ONR7aمي‌باشد اما به ازاي هر 1000 سي‌سي محيط 15 گرم آگار بدان افزوده شده است، پس از شفاف کردن هر کدام از محلول هاي A, BوC از طريق جوشاندن، آن‌ها در دماي C? 121 به مدت 15 دقيقه اتوکلاو شده‌اند. پس از اينکه دماي محيط به حدود C? 45 رسيد فنل حل شده درآب مقطر استريل که فيلتر شده بدان اضافه شده است سپس محلول‌هاي A ,Bو C را به نسبت 2,2و1 با هم آميخته و در نهايت پس از تقسيم در پليت داخل يخچال و در تاريکي نگهداري شده‌اند.
3-1-4 محيط مارين براث (MB)
محيط مارين براث به صورت بسته بندي آماده از شرکت زيست کاوش ايرانيان در بسته بندي 500 گرمي خريداري شده و با توجه به دستور‌العمل قيد شده بر روي بسته‌بندي محيط‌ کشت تهيه و مصرف شده است. ترکيب اين محيط در جدول 3-2 آمده است:
جدول 3-2: ترکيبات محيط کشت مارين براث (MB)
ترکيبات
وزن (گرم)
Sodium Chloride
????
Magnesium Chloride
???
Bacteriological Peptone
?
Sodium Sulfate
????
Calcium Chloride
???
Yeast Extract
?
Potassium Chloride
????
Sodium Bicarbonate
????
Ferric Citrate
???
Potassium Bromide
????
Strontium Chloride
?????
Boric Acid
?????
Disodium Phosphate
?????
Sodium Silicate
?????
Sodium Fluoride
?????
Ammonium Nitrate
?????
PH = ?????????
55.20 گرم از محيط مارين براث در يک ليتر آب حل شده و پس از همگن شدن, محيط به مدت 15 دقيقه در فشار 15 پوند در دماي 121 درجه سانتيگراد اتوکلاو شده سپس محيط در ظروف استريل تقسيم شده و مورد استفاده قرار گرفته است. اين محيط حاوي انواع نمک‌ها و ترکيبات دريايي است که جهت رشد باکتري‌هاي دريايي مورد استفاده قرار مي‌گيرد.
3-1-5 محيط مارين آگار (MA)
براي تهيه اين محيط به ترکيبات محيط مارين براث, به ازاي هر 1000 ميلي ليتر محيط مقدار 15 گرم آگار اضافه شده و پس از همگن شدن محيط, در دماي 121 درجه سانتيگراد در فشار 15 پوند به مدت 15 دقيقه اتوکلاو شده است. سپس هنگامي که دماي محيط به حدود 45 درجه رسيد در پليت‌هاي استريل ريخته شد و پس از سرد شدن مورد استفاده قرار گرفت.
3-1-6 محيط نوترينت براث (NB)
اجزاي تشکيل دهنده آن در يک ليتر به شرح زير است:
جدول 3-3: ترکيبات محيط کشت نوترينت براث
ترکيبات
وزن(گرم)
پپتون گوشت
?
عصاره گوشت
?
pH =??

پس از همگن کردن محيط، در دماي C? 121 به مدت 15 دقيقه در فشار 15 پوند اتوکلاو شده است.
3-1-7 محيط نوترينت آگار (NA)
به ازاي تهيه يک ليتر محيط نوترينت آگار به ترکيبات تشکيل دهنده محيط نوترينت براث به مقدار 15 گرم آگار افزوده و پس از همگن شدن محيط در دماي 121 درجه سانتيگراد, فشار 15 پوند به مدت 15 دقيقه اتوکلاو شده و پس از کاهش دماي محيط تا حدود 45 درجه سانتيگراد در پليت‌هاي استريل ريخته و پس از سرد شدن مورد استفاده شده است.

3-2- محلول‌ها
3-2-1 سرم فيزيولوژي
اجزاي تشکيل دهنده آن در يک ليتر به شرح زير است :

جدول 3-4: ترکيبات سرم فيزيولوژي
ترکيبات
وزن(گرم)
آب مقطر
1 ليتر
NaCl
10 گرم
pH = ?

همچنين اين سرم را از ترکيبات زير نيز بدست آورده شد:

جدول 3-5: ترکيبات سرم فيزيولوژي
ترکيبات
وزن(گرم)
آب شهري
1 ليتر
NaCl
???? گرم
pH =??

در هر لوله آزمايش به ميزان 9 سي‌سي سرم فيزيولوژي تقسيم شده و اتوکلاو گرديده است.

3-2-2 محلول اتيلن‌دي‌‌آمينو‌تترا‌استيک‌اسيد (EDTA)
EDTA در استخراج DNA و بافر ليزکننده‌‌ي سلول‌هاي باکتري به کار رفته, EDTA به صورت 5/0 مولار تهيه شده است.
طرزتهيه: چون وزن مولکولي اين ماده 24/372 است, بنابراين براي سا
خت محلول 5/0 مولار، 12/186 گرم از پودر EDTA در 800 ميلي‌ليتر آب دو بار تقطير استريل حل گرديد و سپس با مگنت به خوبي هم زده شد. درحين به همزدن، pHآن روي 8 تنظيم گرديد پس از اينکه pH در 8 تنظيم شد، حجم نهايي به يک ليتر رسانده شد و محلول در دماي اتاق نگهداري گرديد.
3-2-3 محلول Tris-Base
محلول Tris-Base يک بافر است که در ساخت محلول‌هاي TBE به کار مي‌رود که خود براي نگهداري DNA استخراج شده استفاده مي‌شود. همچنين Tris-Base در ساخت محلول TBE بافر، جهت الکتروفورز و تهيه‌ي ژل آگارز به کار مي‌رود.
طرزتهيه: وزن مولکولي اين ترکيب 14/121 است اين محلول به صورت 1 مولار


دیدگاهتان را بنویسید